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12個做標準曲線過程中的常見問題

2021-03-25 08:56 
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/ 標準曲線 /

經典問題

標準曲線的制作中,經常會有這樣那樣的問題,比如:一定要做5個點?線性相關系數R值必須幾個9才達標?標曲是每天都做還是每次都做?標曲是否必須通過原點?

今天小編為大家整理了標曲相關的12個經典問題,一起來看看吧!


1、標準曲線的做法依據?

GB/T22554-2010《基于標準樣品的線性校準》中:

1、標準曲線的濃度范圍應覆蓋正常操作條件下的被測量范圍;

2、標準樣品的組分盡量與被測樣品組分一致;

3、標準樣品的濃度值應等距離的分布在被測量范圍;

4、標準樣品數量至少應有3個濃度;

5、每個標準點至少重復2次,這個重復是指從稀釋開始。

如果國家標準有相應的濃度系列推薦,盡量按國家標準。工作中我們經常采用線性校準,因為線性方程最為簡潔。


2、什么是校準曲線?

校準曲線包括標準曲線工作曲線,前者用標準溶液系列直接測量,沒有經過預處理過程,這對于樣品往往造成較大誤差;而后者所使用的標準溶液經過了與樣品相同的消解、凈化、測量等全過程。


3、首先標曲要做幾個點?

標準曲線需要幾個數據點,是由所檢測組分的濃度范圍、分析儀響應特性、干擾因素、濃度與檢測信號響應類型有關的。


3個點:對于一些低濃度,特別是微量分析,且濃度范圍不是很大的,檢測器響應可靠,背景干擾非常小的,則可以選用較少的工作點就行,一般有3個濃度點就足夠了,有些甚至可以只用一個濃度點就行,另一個點直接用坐標原點。
4~6個點:對于平時測量的樣品濃度范圍較寬,并且檢測器響應不完全是一次曲線(直線)的,可采用二次曲線或分段校正方式,以減少數據偏差,這種情況就需要多用幾個數據點,如果不分段,數據點有4~6 個就夠用。
至少兩個點:但如果是分段校正,則每段需要至少兩個數據點。而對于一些樣品無濃度范圍規律的,特別是一些檢測機構,如果分析儀的檢測響應可靠,環境因素影響少的,可以做校正曲線。若是環境因素影響大的,則不必做校正曲線,而采用標準加入法或標準加入-一次稀釋法反而簡便一些。

實際上,我們一般是做五個點(不包括零濃度);一般以檢出限的5~10倍為第一個點,以后根據1倍遞增,最高濃度是最低濃度的10~20倍為宜(理化分析實驗為例)。當然,要根據儀器的靈敏度來調整。


4、標曲R值是幾個9才合格?

實驗室應按檢測標準(方法)的要求使用標準溶液或標準物質建立標準曲線。所用標準溶液或標準物質應覆蓋被測樣品的濃度范圍。檢測標準(方法)如無具體的要求,至少使用5個標樣(除空白外)建立線性標準曲線,每個點重復測定1-3次,對于篩選方法,線性回歸方程的相關系數不應低于0.98,對于確證方法,相關系數不應低于0.99。

其實,大于0.99是判斷是否為線性相關的一個標準,實際應用中線性大于0.999才是比較理想的。線性在0.99到0.999之間的監測結果只用接近最高濃度一半(中間濃度)的位置才比較準確,如果線性大于0.999的話,在整個線性范圍內都會有一個比較滿意的結果。

如果檢測的線性不好,可以減少標準的覆蓋范圍,將標準的濃度調整到待測樣品濃度附近,這樣結果也是非常準確的。例如,樣品的濃度約20ppb,但在0~50ppb范圍建立標準曲線,但線性非常不理想,這時可以將標準范圍調整到15~25ppb之間,作五個標準。


5、標準曲線的檢驗?

(1)線性檢驗:

即檢驗校準曲線的精密度。對于以4-6個濃度單位所獲得的測量信號值繪制的校準曲線,分光光度法一般要求其相關系數 | r | ≥0.9990,否則應找出原因并加以糾正,重新繪制合格的校準曲線。


(2)截距檢驗:

即檢驗校準曲線的準確度,在線性檢驗合格的基礎上,對其進行線性回歸,得出回歸方程 y= a+bx ,然后將所得截距a與0作t檢驗,當取95%置信水平,經檢驗無顯著性差異時,a可做0處理,方程簡化為y= bx,移項得x=y/b。在線性范圍內,可代替查閱校準曲線,直接將樣品測量信號值經空白校正后,計算出試樣濃度。


當a與0有顯著性差異時,表示校準曲線的回歸方程計算結果準確度不高,應找出原因予以校正后,重新繪制校準曲線并經線性檢驗合格。在計算回歸方程,經截距檢驗合格后投入使用。


回歸方程如不經上述檢驗和處理,就直接投入使用,必將給測定結果引入差值相當于解決a的系統誤差。


(3)斜率檢驗:

即檢驗分析方法的靈敏度,方法靈敏度是隨實驗條件的變化而改變的。在完全相同的分析條件下,僅由于操作中的隨機誤差導致的斜率變化不應超出一定的允許范圍,此范圍因分析方法的精度不同而異。例如,一般而言,分子吸收分光光度法要求其相對差值小于5%,而原子吸收分光光度法則要求其相對差值小于10%等。


6、標準曲線有效期的規定?

(1)標準曲線屬于實驗室質量控制的范圍,按照《實驗室資質認定評審準則》中結果控制的要求:定期使用有證標準物質(參考物質)進行監控和/或使用次級標準物質(參考物質)開展內部質量控制。


(2)準則中并未對“定期”進行規定,所以如果“定期”,就根據實驗室的實際情況來定了。


(3)既然準則上沒說明,那根據一般的分析教材,當實驗條件(包括藥劑、人員、儀器等)發生變化時,最好重新制作標準曲線。一般來說儀器如果長期使用,并經過檢定,是處于穩定狀態,而人員藥劑的變化往往會較大。如果說每次換個人操作都要換曲線,那工作量就太大了。


7、每次開機都必須做標準曲線?


從檢測的要求來說,因為:

1、每天所配的流動相都會有所不同,導致出峰的時間都會有一定的差異,峰面積相應都有所差異。
2、檢測器光能也在不斷的衰弱,因此其每天的相應值也有所不同,其峰面積也有差異。
基于以上原因,原則上應該是每天都要進行標準曲線校正的。
標準曲線不要每次都做,但是每次必須進標準品樣品;因為每次你的流動相和原來的不可能完全一樣,同時儀器的狀態也在變化,所以不同批次間的保留時間是不一致的,所以你必須用隨行標準品來定位與定量。


8、校準曲線能不能長期使用?

每批樣品應測定一個校準曲線中間點濃度的標準液,其測定濃度與校準曲線標準點的濃度相對誤差不得超過規定范圍,如果超過規定相對誤差,需重新繪制校準曲線。

也可以這樣說,不同的分析項目,不同的分析方法,校準曲線斜率的穩定性不同。如校準曲線的斜率較為穩定,則在樣品分析時,可只測定兩個標準點,當此兩個標準點與原曲線相應點的相對偏差均小于5%時,可使用原校準曲線。因此,樣品分析前,需根據斜率的穩定性來確定是否需同時制作校準曲線。

一般的做法,根據檢測的頻率來做,如果該項目天天都要檢測,并且檢測量較多時,要求至少每周做一次曲線。如果檢測量上,一個月數量極少的話,就一個月做一次曲線。當然,儀器如果出現故障并大修后回來的,經過檢定后,需要重新做曲線。


9、標準曲線是否必須過原點?

標準曲線不一定非要過原點,只要線性好就可以了。因為做空白的話基本上不會過原點。過原點是強制過的,實際曲線可能不過,就會造成誤差。不過原點是因為有系統誤差。


針對是否過原點(0,0)問題,我想可以從原點(0,0)代表的意義來考慮:即所測組分濃度為零的時候,信號響應值(液相色譜也就是峰高或者峰面積)是否也為零。通常來說色譜分析是屬于這種情況的,因而可以把(0,0)點作為一個濃度水平計入標準曲線(甚至不需要真的去配一個濃度為零的標準溶液來進樣),這也是單點法定量的一個依據;而類似的情況在光譜法測定時就講不通了,濃度為零的標準溶液(本底)響應信號(吸光度)往往不是零,這個時候標準曲線就不一定過原點了。


10、標準曲線的線性范圍?

線性范圍這個大家都比較清楚,主要從相關系數r看,一般要求r大于等于三個九。之前做實驗有時候濃度高時,線性不好,高濃度點不在標準曲線上,而是在標準曲線的下面,而且離擬合的標準曲線比較遠。遇到這種情況,標準曲線的線性相關系數就很差,有時候才一個九,最后我終于想明白了,如果自己用手動擬合的話,用平滑的曲線去連接所有點的話,你就會發現,如果在線性范圍內,連接起來就是直線,如果超出了線性范圍,連接起來就是一條彎曲的曲線。


11、相關系數的有效數字?

GB5750.3-2006 8.2.7項有如下規定:校準曲線相關系數只舍不入,保留到小數點后出現非9的一位,如0.99989→0.9998。如果小數點后都是9時,最多保留小數點后4位。


12、Y=bX和二次曲線的選用?

標準曲線我們通常采用的是Y=a+bX,曲線擬合完必須要做統計檢驗,且要做統計完備的線性檢驗和失擬檢驗,然后再做a與0的差別檢驗,如果a與0的統計學上無差異,你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線,擬合出來后同樣做線性檢驗和失擬檢驗,如果線性檢驗合格(P<0.05)且失擬檢驗合格(p>0.05)此時你就可以采用Y=bX。


二次曲線的采用同樣是這樣的道理,如果你Y=a+bX時擬合不合格,你就考慮用Y=a+bX+cX2,同樣做失擬檢驗,考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗和失擬檢驗合格,則采用Y=a+bX形式,這樣符合統計學上參數最少的統計簡潔性原則。


標準曲線法有一定的優勢,也有一定的缺陷,它特別適合于大量樣品的分析。但由于每次樣品分析的色譜條件(檢測器的響應性能,柱溫,流動相流速及組成,進樣量,柱效等)很難完全相同,因此容易出現較大誤差。此外,標準工作曲線繪制時,一般使用欲測組分的標準樣品(或已知準確含量的樣品),而實際樣品的組成卻千差萬別,因此必將給測量帶來一定的誤差。


了解各個分析項目校準曲線斜率的穩定性及影響穩定性的主要因素,可決定是否能采用帶標點檢驗原校準曲線,省略重新制作校準曲線;從校準曲線斜率的變化,可判斷標準溶液的穩定性,從而確定其標定周期;分析低濃度樣品時,應使用高純度的水和試劑,以減少空白值,降低樣品的分析誤差。

來源:食品實驗室服務

希望以上內容對您有所幫助!

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